Неврология, психиатрия и оксидативный стресс. Защитные свойства «Гитагамп — Рутин Железо GRuI»

И.Г. Гитлин, Е.З. Гольдберг Закрытое акционерное общество «нпк эхо»

Гитлин Исаак Григорьевич / info@npk-echo.ru

Ключевые слова: неврология, дыхательная недостаточность, радиопротектор, активные формы кислорода (АФК), нейродегенеративные заболевания.

Резюме: С окислительным стрессом связывают развитие многих заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона, бокового амиотрофического склероза, а также сердечно-сосудистые заболевания 1, 2, 3. Недавняя публикация4 в журнале Практическая Медицина о новом антиоксиданте, побудила нас продолжать изложение уникальных особенностей соединения. В предлагаемых исследованиях свойств Гитагамп-Рутин Железа, активный компонент - RuFe3AA0.5Ctr5 (Цитрат рутин-железа(III)-аскорбиновой кислоты), проявляет как радиопротекторные свойства, так и оказывает воздействие на парциальное давление кислорода в здоровой мышечной ткани. В данном исследовании мы показываем что Гитагамп-Рутин Железо позволяет значительно снизить концентрацию перекиси водорода до нормальной. Мы надеемся, что наш вывод будет представлять интерес для врачей и исследователей в области неврологии.

Введение

Воздействие на организм ионизи­рующего излучения (малые и сред­ние дозы) и оксидативного стресса (стрессы от физических или нервно-психологических нагрузок) протекает c подобным механизмом воздействия на организм.

Стадии воздействия радиоактивного излучения на биологические объекты: Физическая — поглощение энергии излучения; образование ионизирован­ных и возбужденных атомов и молекул 10–16 — 10-15 с.

Физико-химическая — перераспре­деление поглощенной энергии внутри молекул и между ними, образование свободных радикалов 10-14 — 10-11 с.

Химическая — реакции между сво­бодными радикалами и между ними и исходными молекулами. Происходит образование широкого спектра молекул с измененными структурой и функцио­нальными свойствами 10-6 — 10-3 с.

Биологическая — последовательное развитие поражения на всех уровнях биологической организации от суб­клеточного до организменного. Секун­ды — годы.

Время жизни возникающих частиц составляет от долей наносекунд до секунд для сравнительно долгоживу­щих частиц. Так NO-нитроксильный радикал-10-1 сек, RO органические пе­рекиси — 10 сек, Н₂Н₂

Основным поражающим факто­ром радиационного воздействия является воздействие пероксида во­дорода (стандартный окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) — 1.77В относительно насыщен­ного водородного электрода).

При моделировании окислительного стресса используют прием добавления пероксида водорода в культуральную жидкость7,8. При этом оптимальной ко­нечной концентрацией Н₂Н₂

Нейтрофил является ключевой клет­кой в развитии ОВ. С одной стороны, он относится к клеткам-эффекторам очага воспаления, где запускает целый каскад молекулярных механизмов, от которых зависит, перейдет ли процесс в хрони­ческую фазу или наступит разрешение воспаления. С другой стороны, нейтро­фил выступает продуцентом веществ, принимающих участие в развитии и поддержании воспаления, к числу ко­торых относятся: активные формы кис­лорода (АФК), ферменты азурофильных и специфических гранул, провоспали­тельные цитокины (фактор некроза опухоли α (TNFα), интерферон, интер­лейкины (IL) -1, -8 и др.), лейкотриены, простагландины, факторы сосудистой проницаемости и иные биологически активные вещества9,10,11.

Дисфункции нейтрофилов приводят к тяжелым формам подверженности больных бактериальным инфекциям, что подчеркивает ключевую роль ней­трофилов в обеспечении врожденной формы иммунитета. С другой стороны, гиперактивация нейтрофилов также приводит к патологиям. Такие анома­лии, как повреждение при реперфузии. Примерно в 30% подобных наблюдений развивается так называемый «синдром реперфузии», обусловленный неспо­собностью энергетической системы кардиомиоцитов утилизировать по­ступающий кислород и субстраты син­теза АТФ. Синдром дыхательной не­достаточности взрослых дыхательная недостаточность — состояние, харак­теризующееся нарушением нормаль­ного газового состава артериальной крови: доставки достаточного количе­ства кислорода в артериальную кровь и выведения соответствующего количе­ства углекислого газа из венозной кро­ви в альвеолы. Нарушение легочного газообмена приводит к уменьшению раО2(гипоксемии) и увеличению раСО2(гиперкапнии). Диагностический кри­терий острой дыхательной недостаточ­ности — снижение раО2 ниже 50 мм рт. ст. и/или раСО2 больше 50 мм рт. ст. при отсутствии внутрисердечного шунти­рования.

На рис. 1 приведен пример Кривой диссоциации оксигемоглобина.

Вид этой кривой диссоциации ок­сигемоглобина обычно определяется такими параметрами как значение температуры Т, рН, парциальное дав­ление СО2. Вполне справедливо пред­ставление существования газообраз­ного кислорода в плазме крови как системы, создающей определенный окислительно-восстановительный потенциал12,13. Естественно рассматри­вать окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) как один из пара­метров гомеостаза. Влияние на ОВП производят все системы, поскольку окислительно-восстановительные про­цессы вовлечены в систему жизнеобе­спечения организма. Значение ОВП от­носительно насыщенного водородного электрода составляет примерно 200 мВ. Реальная картина представляет собой довольно сложное взаимодействие мно­гих факторов как окислительной так и восстановительной природы, для представления интегрального зна­чения результирующего значения окислительно-восстановительного по­тенциала можно воспользоваться вилом Лютера.

Правило Лютера позволяет рассчи­тывать электродные потенциалы труд­нореализуемых реакций без непосред­ственного измерения.

Общее правило: увеличение актив­ности веществ Ox сдвигает электро­дный потенциал в «плюс», а увеличе­ние активности веществ Red сдвигает электродный потенциал в «минус».

Правило Лютера: произведения nEi аддитивны, что вытекает из аддитив­ности ΔG и соотношения

ΔG0 = –nFE0

Е0 = = — ΔG0/nF,

где ΔG0 — стандартное изменение свободной энергии Гиббса.

На практике для определения окислительно-восстановительного потенциала строят электрохимиче­ские цепи из некоторого стандартно­го электрода и электрода, на котором протекает соответствующий редокс-процесс. В водных растворах в качестве стандартного используют водородный электрод. В такой цепи эдс прирав­нивается к значению окислительно-восстановительного потенциала и вы­ражается уравнением Нернста:

где ai — активности участников редокс-процесса, vi — их стехио-метрич. коэффициенты, R — универсальная га­зовая постоянная, T — абсолютная тем­пература, F — число Фарадея, причем для исходных в-в принимается vi<0, а для продуктов р-ции vi >0. Стандарт­ный потенциал Е0 равен окислительно-восстановительному потенциалу при активностях (или/и фугитивностях) компонентов, равных единице, и за­висит от природы редокс-процесса и от температуры. Таким образом, окислительно-восстановительный по­тенциал (ОВП) можно рассматривать как меру стандартной свободной энер­гии редокс-процесса.

Изменение значение потенциала ги­потетического кислородного электродапри значениях парциального давления кислорода 30; 20; 10 мм рт. ст. по срав­нению с физиологически нормальным рО2=40 мм рт. ст.

Зависимость электродного потен­циала кислородного электрода от рН

Р(О₂) — парциальное давление кис­лорода, атм; а`ОН¯ — активность гидрок­сильных ионов; F — число Фарадея (96500 г×экв); R = 8,31 Дж/(К×моль) — газовая постоянная; T — абсолютная температура, К. Для температуры 370С и при значении рН=7,4

ЕО₂= 0,774 +0,0154lg рО₂;

В норме гомеостаз — способность открытой системы сохранять посто­янство своего внутреннего состояния посредством скоординированных реак­ций, направленных на поддержание ди­намического равновесия поддерживает постоянными основные параметры.

Согласно принципу Ле Шателье — Брауна, если на систему, находящую­ся в устойчивом равновесии, воздей­ствовать извне, изменяя какое-либо из условий равновесия (температура, давление, концентрация, окислительно-восстановительный потенциал), то в системе усиливаются процессы, на­правленные на компенсацию внешне­го воздействия. При увеличении кон­центрации пероксида водорода или гипохлорита натрия, для поддержания окислительно-восстановительного по­тенциала, в системе происходит умень­шение равновесного парциального давления кислорода как наиболее до­ступного для регулирования фактора. Естественная система защиты (ЕСЗ) организма от действия перекисей опре­деляется кооперативным действием ферментов, белков и низкомолекуляр­ных соединений14: В силу генетических особенностей или возрастных измене­ний в организме, ЕЗС не обеспечива­ет необходимые защитные функции. В энергетической системе организма образуется некоторый стационарный избыток перекиси водорода по сравне­нию с состоянием молодого здорового организма.

Материалы и методы

Защитные свойства препарата Гита­гамп Рутин Железо (GRuI) были оха­рактеризованы двумя стандартными методами определения концентрации перекисных радикалов: в растворе — по окислению люминола (1) и вну­три клеток человека — по окислению 2’7’дихлорофлюоресцеина (2).

Способность препарата GRI раз­лагать перекись водорода в растворах производилась в стандартной среде для культивирования клеток DMEM с 10% сыворотки. Для этого в культуральную среду, содержащую перекись водорода (350 мкМ), добавляли GRI до концен­трации 0,375 мкг/мл. Через определен­ные промежутки времени производили отбор аликвот среды, где по окислению люминола определяли содержание перекиси (см. табл.). Представленные результаты показывают, что GRI в от­личие от контрольного препарата уже в первые минуты вызывает резкое сни­жение содержания перекиси водорода в среде и полностью элиминирует пере­кись уже через 4 часа после добавле­ния.

Поскольку GRuI продемонстриро­вал выраженные защитные свойства, мы предположили, что данный пре­парат также будет препятствовать накоплению экзогенных перекисей внутри клеток. Для проверки нашего предположения в культуральную среду клеток НСТ-116 (клетки рака толстой кишки) вносили GRuFe (до концен­трации 0,375 мкг/мл), через 1 час ин­кубации добавляли перекись водорода (до концентрации 700 мкМ). Еще че­рез 4 часа методом проточной цитоме­трии по флюоресценции окисленного 2’7’дихлорофлюоресцеина в клетках было определено относительное со­держание перекисных радикалов.

Как видно по расположению пи­ков флуоресценции, добавление GRuI в среду клеток, обработанных переки­сью водорода уменьшает содержание внутриклеточных перекисей до уров­ня отрицательного контроля (клеток не обработанных перекисью).

Методы Клеточные линии

В работе использовали клеточные линии HCT-116 (рак толстой кишки), культивировали с использованием сре­ды DMEM, с добавлением 10% эмбрио­нальной бычьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептоми­цина.

Определение выживаемости кле­ток методом окраски метиленовым синим

Клетки в монослое фиксировали ме­тиловым спиртом и затем окрашивали метиленовым синим (0,5% метиленовый синий в 50% метаноле). Относитель­ную выживаемость клеток оценивали спектрофотометрически (по разнице значений измерений, произведенных при 650 нм и 540 нм) после экстракции метиленового голубого 1%-ным раство­ром SDS (1).

Определения количества переки­сей по окислению люминола

К аликвотам среды добавляли 15 мкМ люминола и пероксидазу хрена (8mU/ml). Интенсивность люминесцен­ции определяли при помощи прибора Wallac 1420 (2).

Определение количества внутри­клеточных перекисных радикалов

2x106 клеток НСТ-116 инкубировали в темноте в присутствии 2,5 мкМDCF при 37°C в течение 30 минут. После инкубации клетки дважды отмывали фосфатно-солевым буфером, трипсини­зировали и анализировали на проточ­ном цитометре (BD FACSCalibur) (3).

1. Скорость разложения

перекиси водорода

Перекись водорода добавлялась:

Контроль к культуре клеток НСТ-116 (клетки рака толстой кишки)

Рутин к культуре клеток НСТ-116 и Рутину (0.375мг/мл)

Гитагамп RuFe к культуре клеток НСТ-116 и Гитагамп RI (0.375мг/мл)

2. Защитное действие

«Гитагамп–RuI»

Клетки HCT-116 обрабатывали при внесении 50 мкг, 5 мкг и 0.5 мкг «Гита­гамп — RuI» на лунку 1 час и вносили перекись в количестве 150 мкМ, 350 мкМ, 700 мкМ.

Результат регистрировали через 20 часов.

Поскольку препарат GRuI оказал­ся эффективным антиоксидантом мы предположили, что его добавление к клеткам, позволит увеличить их вы­живаемость в условиях оксидативного стресса. Клетки HCT-116 рассевали на 96-луночный планшет в количестве 5х104 на лунку. Через сутки клетки об­рабатывали «Гитагамп — RuI» (500 мкг, 50 мкг и 5 мкг на 1 мл культуральной среды) в течение 1 часа и вносили пере­кись в количестве 150 мкМ, 350 мкМ, 700 мкМ. Результат регистрировали через 20 часов.

Наблюдаются выраженные защитные свойства 500 мкг «Гитагамп — RuFe» от оксидативного стресса, вызванного 700 мкМ Н2О2.

III. Радиопротекторные свойства «Гитагамп — Рутин Железо» GRuI. (ГНЦ — Институт биофизики, Мо­сква, Научно-исследовательский ин­ститут им. Гамалея РАМН, Москва.

Известно, что одним из основных повреждающих факторов, сопутствую­щих радиационному поражению в усло­виях in vivo, является оксидативный стресс. Выраженные антиоксидантные свойства препарата «Гитагамп — Рутин Железо» и его способность увеличивать выживаемость клеток в условиях окси­дативного стресса в условиях in vitro позволили сделать предположение, что данный препарат может использо­ваться в качестве радиопротективного средства.

Проверку радиопротекторных свойств «Гитагамп — Рутин Железо» проводили на мышах линии С57/Black6 весом 18-22 г. Две группы мышей, по 10 в каждой, получили дозу гамма об­лучения 8 Грэй каждая. Испытуемая группа получила перорально по 10 мг «Гитагамп — Рутин Железо» за четыре часа до облучения.

В контрольной группе на момент пре­кращения наблюдений потери составили 5 мышей, в испытуемой группе — 2.

I. Влияние «Гитагамп — Рутин Железо» (GRI) на степень оксиге­нации здоровой мышечной ткани животных (Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена)

Исследование проводились на мы­шах гибридах F1 (CBAxC57bl/6j), сам­цы массой 25-27 г. Препарат вводили в виде суспензии однократно перорально в дозе равной 500 мг/кг.

Для оценки напряжения (уровня) кислорода в здоровой мышце живот­ных использовали метод, основанный на тушении кислородом фосфорес­ценции сенсора — мезо-тетрафинил-тетрабензопорфина палладия (PdμPh4TBP).

Фосфоресценцию PdμPh4TBP воз­буждали импульсами (t -20 мкс) He-Ne лазера (λ-633 нм, мощность 50 мВт). Кинетика затухания фосфоресценции, зависящей от парциального давления кислорода в окружающей сенсор био­среде, регистрировалась с помощью фотоумножителя. Регистрацию напря­жения кислорода проводили в течение двух часов после введения БАД.

Выводы:

В результате проведенного исследо­вания было установлено, что однократ­ное пероральное применение БАД «Ги­тагамп — RI» в дозе 500 мг/кг отмечен (в виде тенденции) рост парциального давления в здоровой мышечной ткани мышей через 2 часа после применения с 27 +10 мм рт. ст. до 38+15 мм рт. ст.

Влияние «Гитагамп RI” на динами­ку роста первичной опухоли LLC. (Мо­сковский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Гер-цена, ЗАО «НПК ЭХО»)

Мыши: BDF1, самки массой 20-22 г.

Опухоль: карцинома Легких Льюис (LLC) (перевивали внутримышечно по 30 мг опухолевого материала).

Лечение начинали через 48 ч. после перевивки LLC.

Рутин-железо вводили перорально ежедневно в разовых дозах 25 мг/кг и 125 мг/кг в течение 30 дней (курсо­вые дозы 757 мг/кг и 3750 мг/кг соот­ветственно).

ТРО — торможение роста опухоли.

Вывод: В условиях приема препа­рата через 48 часов после прививки первичной опухоли «карцинома Лег­ких Льюис (LLC)» практически ника­кого отрицательного действия (опухоль стимулирующего влияния) препарат не оказывает.

Заключение

Новое соединение играет роль вне­клеточной «Каталазы». Причем вне за­висимости от факторов, снижающих активность фермента каталазы.

При внешних воздействиях — (иони-зирующее излучение, или развитии стресса, развитии острых или хрониче­ских воспалений) — происходит увели­чение ОВП за счет роста концентрации пероксида водорода. При нарушении ЕСЗ могут происходить существенные органические поражения.

Способность Гитагампа — Рутин-железа эффективно нейтрализовать по­следствия развитии стресса, и развития острых или хронических воспалений иллюстрируется исследованиями хеми­люминесценции цельной крови проведенными по методу профессора Новикова (МГУ Ломоносова). На рисунке видно, что уже после месячного курса происходит кардинальное снижение количества перекиси водорода.

Снижение интенсивного хемилюминесенции свидетельствует о снижении количества свободной перекиси в крови. Снижение происходит до уровня показателей молодого здорового организма.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Simon AS et al, “Altered DNA repair, oxidative stress and antioxidant status in coronary artery disease” Journal of Biosciences, 2013 Jun;38(2):385-9.

2. Hwang O, “ Role of oxidative stress in Parkinson’s disease” Experimental Neurobiology 2013 Mar;22(1):11-7.3. Koriyama Y, Nakayama Y, Matsugo S, Kato S , “Protective effect of lipoic acid against oxidative stress is mediated by Keap1/Nrf2-dependent heme oxygenase- 1 induction in the RGC-5 cellline” Braing Research, 2013 Mar 7;1499:145-57

4. М.Н.Захарова, Б.С.Народитский, Д.Ю.Логунов, И.Г.Гитлин. «Практиче­ская медицина» 1(56) 2012г

5. Патент РФ 2309740, Евразий­ский патент 0166466, патент Китай ZL80033434.X, США, Канада

6. Ю.А. Александров. /.Основы ра­диационной экологии: Учебное пособие /Мар. гос. ун-т; – Йошкар-Ола, 2007/.

7. Стариков Юрий Витальевич, Ав­тореферат, « Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтро­филов при окислительном стрессе». Новосибирск-2008,

8. Часовских Наталия Юрьевна «Мо­лекулярные механизмы апоптоза при окислительном стрессе», Автореферат, Томск – 2009./

9. Influence of oxidative stress on redox-state and peripheral bloodheterophilic leucocytes apoptotic program realization / T.V. Zhavoronok, Ye.A. Stepovaya, N.V. Ryazanceva et al. // Eur. Journal of Nat. History. – 2007. – № 6. – P. 63-64/.

10. Жаворонок Т. В. «Редокс- зави­симые механизмы изменений функ­циональных свойств нейтрофилов при остром воспалении и окислительном стрессе» Автореферат. Томск 2012

11. O. Grimstad, O. Sandanger, L. Ryan et al. «Cellular sources and inducers of cytokines present in acute wound fluid» / // Wound Repair Regen. 2011. - V. 19, N 3. - P. 337-347.

12. М. Ш. Хубутия и др «Измерения потенциала платинового электрода в крови, плазме и сыворотке крови» // Электрохимия, 2010, том 46, № 5, с. 569–573/

13. Никольский Б.П.,и др. Оксредме­трия. Л.: Химия, 1975./

14. А.А. Подколзин и др. «Система антиоксидантной защиты организма и старение». Профилактика старения Выпуск 3 2000.