Влияние композиции клеточных стенок Bifidobacterium bifidum и Saccharomyces cerevisiae на выживаемость мышей в условиях экспериментального сепсиса

Калюжин О.В., Гитлин И.Г., Калина Н.Г., Мулик Е.Л., НародицкийБ.С., Логунов Д.Ю., Тухватулин А.И.

Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН, Москва; Закрытое акционерное общество «НПК ЭХО», Москва; Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, Москва; Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи, Москва

E-mail: kalyuzhin@list.ru

Компоненты клеточных стенок бактерий и дрожжевых грибов обладают выраженной иммунотропной активностью, которая реализуется главным образом через образраспознающие рецепторы (pattern recognition receptors – PRR) клеток врождённого иммунитета. PRR узнают высококонсервативные патоген- или комменсал-ассоциированные молекулярные структуры бактерий и грибов (pathogen/commensal-associated molecular patterns – РАМР/CAMP) [1].

К наиболее известным бактериальным PAMP/CAMP, которые обусловливают биологическую активность многих иммуномодуляторов, выделенных из бактерий, относят компоненты их клеточных стенок – липопротеины и пептидогликаны – и структурные субъединицы последних: N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин (МДП) и γ-D-глутамил-диаминопимелиновую кислоту (ГДАПК) [18]. Ранее считали, что пептидогликаны связывают поверхностные рецепторы TLR2, что ведет к MyD88-зависимой активации NF-κB [7]. Сейчас установлено, что за активацию TLR2 отвечают не сами пептидогликаны, а ассоциированные с ними липопротеины [21]. Однако при деградации пептидогликанов высвобождаются их биологически активные компоненты МДП и ГДАПК, которые взаимодействуют, соответственно, с цитозольными рецепторами NOD2 и NOD1, запуская RIP2-зависимую активацию NF-κB [11, 13].

Структурные компоненты клеточных стенок дрожжевых грибов – β-(1,3)/(1,6)-глюканы – также обладают доказанной способностью стимулировать иммунокомпетентные клетки, а также оказывать опосредованное противоопухолевое действие [9, 20]. Иммуномодулирующей активностью обладают и другие субъединицы клеточной стенки дрожжей – маннаны [19]. Выявлены рецепторы на поверхности нейтрофилов, макрофагов и NK-клеток, опосредующие иммуномодулирующие и другие биологические сигналы грибковых β-глюканов: рецептор комплемента 3 (CR3; CD11b/CD18), лактозилцерамид, дектин-1 (или рецептор β-глюкана, βGR), скавенджер-рецептор макрофагов, CD5, TLR2 и TLR6 [6, 9]. В проведении сигналов от дрожжевых маннанов участвуют TLR4 и CD14 [19].

Кроме того, существуют убедительные данные о том, что β-глюканы действуют как пребиотики, потенцируя рост лактобактерий и бифидобактерий [16], что apriori вносит вклад в модуляцию иммунного ответа.

Анализ литературных данных позволяет спрогнозировать высокую адаптогенную и иммуностимулирующую активность композиции, которая включает в себя одновременно компоненты бактериальных и дрожжевых клеточных стенок.

Целью настоящей работы явилось изучение биологической активности композиции клеточных стенок бифидобактерий (Bifidobacterium bifidum) и пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) в условиях экспериментального сепсиса.

Материалы и методы исследования

Препараты бактериальных и дрожжевых клеточных стенок

В качестве источника клеточных стенок использовали сухие убитые клетки Bifidobacterium bifidum, полученные в соответствии с ТУ 9229-022-16-414608-07, и сырье для биологически активных добавок к пище Нагипол-C (автолизат Saccharomyces cerevisiae) производства ООО «Алина-Фарма» (Московская область, Чеховский район, пос. Любучаны). Клеточные стенки получали по модифицированному методу [8], включающему, помимо трёхкратной экстракции в двухпроцентном водном растворе NaOH, ультразвуковую обработку в течение 40 минут при температуре 70°С на каждом этапе экстракции. Отмытые водой до нейтральной среды и высушенные до порошкового состояния препараты дрожжевых и бактериальных клеточных стенок (соответственно, ДКС и БКС) использовали в работе. Для приготовления матричных разведений препараты растворяли в десятипроцентном водном растворе диметилсульфоксида (10 мг/мл). Рабочие разведения делали в 0,9-процентном растворе NaCl.

Исследование влияния бактериальных и дрожжевых клеточных стенок на выживаемость мышей в условиях экспериментального сепсиса

В эксперименте использовали беспородных мышей массой 14-16 г, полученных из филиала «Столбовая» ГУ Научного центра биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в пластмассовых клетках на естественной диете в виварии НИИ вакцин и сывороток РАМН.

Исследуемые препараты вводили перорально в дозах 2,5; 25 и 250 мкг/мышь (≈ 0,17; 1,7 и 17 мг/кг) в 200 мкл 0,9-процентного раствора NaCl. В контрольной группе животные получали такой же объем 0,9-процентного раствора NaCl. Через 24 часа после введения препаратов мышей заражали культурой StaphylococcusaureusWood 46. Взвесь стафилококков вводили внутрибрюшинно в 0,2% голодном агаре для повышения вирулентных свойств микроорганизмов. Заражающую дозу подбирали по результатам предварительного эксперимента так, чтобы она составляла минимальную дозу возбудителя, вызывающую гибель инфицированных мышей в 80-100% случаев.

Наблюдение за животными продолжали в течение 5 дней после заражения.

В качестве положительного референс-контроля в условиях септической модели использовали β-гептилгликозид-мурамилдипептид (С7МДП) – соединение с изученной биологической активностью и доказанным на моделях сепсиса протективным эффектом [3, 4, 5] – в дозах 1, 10 и 100 мкг/мышь (≈ 0,07; 0,7 и 7 мг/кг). С7МДП синтезирован по методу [2] и любезно предоставлен на испытания профессором А.Е.Земляковым (кафедра органической химии Таврического национального университета им. В.И.Вернадского, Симферополь, Украина).

Статистическая обработка материала

Математическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы Statistica 7.0. Для оценки достоверности различий количественных показателей между двумя независимыми выборками использовали U-критерий Манна-Уитни. Для выявления различий между группами по качественным признакам использовали критерий χ2. Различие считали достоверным при p<0,05.

Результаты исследований и их Обсуждение

На первом этапе определили минимальную дозу возбудителя, вызывающую стопроцентную или близкую к стопроцентной гибель зараженных мышей (табл.1).

По результатам предварительного эксперимента была выбрана доза 10⁹ микробных клеток/мышь. Такая доза должна была с одной стороны обеспечить достаточно «жесткие» условия для экспериментальных животных, с другой – чувствительность к проективному действию исследуемых препаратов.

В серии основных экспериментов указанная доза вызывала падение 100% животных контрольной группы в 2 случаях и 90% мышей в одном эксперименте (табл. 2). Учитывая результаты предварительного эксперимента и серии основных исследований, выбранное число микробных клеток/мышь можно расценить как минимальную летальную дозу возбудителя.

С7МДП (положительный референс-контроль) в дозе 10 мкг/мышь предотвращал гибель 42% зараженных животных (p<0,05). В дозах 1 и 100 мкг/мышь этот низкомолекулярный гликопептид оказывал лишь тенденцию к увеличению (25%) выживаемости инфицированных грызунов.

ДКС проявляли тенденцию к снижению доли павших животных, обеспечивая в максимальной из использованных доз (250 мкг/мышь) выживание 30% зараженных грызунов.

БКС характеризовались более выраженной линейной зависимостью протективного эффекта от дозы, а в дозе 250 мкг/мышь достоверно предотвращали гибель половины зараженных животных (p<0,05), что сопоставимо с действием положительного референс-контроля в дозе 10 мкг/мышь.

Композиция ДКС+БКС превышала по эффективности отдельно взятые препараты клеточных стенок бактерий или дрожжей, а в максимальной из изученных дозировок предотвращала падение инфицированных животных в достоверно большей степени (80%, p<0,05), чем положительный референс-контроль в оптимальной дозе.

ДКС и БКС, выбранные нами в качестве объектов исследования, по литературным данным обладают не только высокой степенью безопасности и эффективности, но и детально изученными клеточными и молекулярными механизмами действия.

В представленной работе БКС проявили несколько большую по абсолютным значениям протективную активность, чем БКС, на модели сепсиса, вызванной минимальной летальной дозой Staphylococcusaureus. Однако, статистически значимых различий в выраженности биологических эффектов между этими препаратами не выявлено.

Служившие источником БКС бифидобактерии известны своей способностью стимулировать защитные механизмы организма, в том числе гуморальные и клеточные звенья адаптивного и врожденного иммунитета [10, 15]. Важно то, что некоторые штаммы Bifidobacteriumbifidumспособны не толькостимулировать противоинфекционный ответ, но и регулировать выраженность воспалительных реакций за счет модуляции дифференцировки Tnaive-клеток [14]. Многие, если не большинство, биологических эффектов симбионтных бактерий обусловлены их клеточными стенками.

Ранее уже было показано, что при сочетанном использовании бактериальных пептидогликанов, дрожжевых β-глюканов и маннанов, действующих как через разные, так и через некоторые общие рецепторно-сигнальные системы, возможен синергизм в активации иммунокомпетентных клеток [12]. Последний факт был учтен при конструировании композиции бактериальных и дрожжевых клеточных стенок.

В настоящей работе составляющие комбинации клеточных стенок Bifidobacterium bifidum и Saccharomyces cerevisiae действовали синергично по предотвращению гибели животных в условиях экспериментального сепсиса.

Вероятно, высокая протективная активность исследуемой композиции связана со способностью её составляющих взаимодействовать с TLR2, TLR4 и некоторыми другими сенсорами PAMP/CAMP на поверхности и внутри клеток врожденного иммунитета, потенцируя действие друг друга, что требует дополнительной экспериментальной проверки.

Таким образом, полученные нами данные позволяют сделать следующие выводы:

1)Клеточные стенки Bifidobacterium bifidum обладают умеренной дозозависимой протективной активностью в условиях экспериментального сепсиса, вызванного минимальной летальной дозой Staphylococcusaureus.

2)Клеточные стенки Saccharomyces cerevisiae проявляют тенденцию к увеличению выживаемости инфицированных мышей.

3)Композиция клеточных стенок Bifidobacterium bifidum и Saccharomyces cerevisiae стимулирует врожденный иммунитет мышей и предотвращает гибель значительной части животных при их заражении минимальной летальной дозой Staphylococcus aureus.

Литература

1.Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Байракова Е.А. и др. Молекулярные механизмы индукции врожденного иммунитета // Вестник РАМН. – 2009. – № 4. – С. 42-49.

2.Земляков А.Е., Чирва В.Я. Синтез гликозидных аналогов N-ацетил-мурамоил-L-аланил-D-изоглутамина // Химия природных соединений. – 1987. - № 5. – С. 714-718.

3.Калюжин О.В., Калина Н.Г., Баштаненко А.Ф. и др. Стимуляция резистентности мышей к бактериальной инфекции гликозидами мурамилдипептида // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2003. – Т. 135. - № 5. – С. 531-535;

4.Калюжин О.В., Калюжин В.В., Земляков А.Е. и др. Стимуляция неспецифической резистентности мышей β-гептилгликозид-мурамилдипептидом. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1999. – Т. 127. – № 5. – С. 543-545.

5.Караулов А.В. Калюжин О.В., Земляков А.Е. Биологическая активность гликозидных производных N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина // Российский биотерапевтический журнал. – 2002. – Т.1. – № 1. – С. 14-24.

6.Akramiene D., Kondrotas A., Didziapetriene J., Kevelaitis E. Effects of β-glucans on the immune system // Medicina (Kaunas). – 2007. – Vol. 43 (8). – P. 597-606.

7.Asong J., Wolfert M.A., Maiti K.K., Miller D., Boons G.-J. Binding and cellular activation studies reveal that Toll-like receptor 2 can differentially recognize peptidoglycan from Gram-positive and Gram-negative bacteria // J. Biol. Chem. – 2009. – Vol. 284 (13). – P. 8643-8653.

8.Bacon J.S.D., Davidson V.C., Jones D., Taylor I.F., The glucan components of the cell wall of Baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) considered in relation to its ultrastructure // Biochemical Journal. – 1969. – Vol. 114. – P. 557-569.

9.Chan G.C.-F., Chan W.K., Sze D.M.-Y. The effects of β-glucan on human immune and cancer cells // Journal of Hematology & Oncology. – 2009. – Vol. 2:25 doi:10.1186/1756-8722-2-25.

10.Erickson K.L., Hubbard N.E. Probiotic immunomodulation in health and disease // J. Nutri. 2000; 130 (2 Suppl. 1): 403S-409S.

11.Franchi L., Park J.-H., Shaw M. H. et al. Intracellular NOD-like receptors in innate immunity, infection and disease // Cellular Microbiology. – 2007. – Vol. 10 (1). – P. 1-8.

12.Huang H., Ostroff G.R., Lee C.K. et al. Distinct pattern of dendritic cell cytokine release stimulated by fungal β-glucans and Toll-like receptor agonists // Infection and Immunity. – 2009. – Vol. 77 (5). – P. 1774-1781.

13.Kawai T., Akira S. The roles of TLRs, RLRs and NLRs in pathogen recognition // Int. Immunol. – 2009. – Vol. 21 (4). – P. 317-337.

14.López P., González-Rodríguez I., Gueimonde M., Margolles A., Suárez A. Immune response to Bifidobacterium bifidum strains support Treg/Th17 plasticity // PLoS One. – 2011. – Vol. 6 (9): e24776. doi:10.1371/journal.pone.0024776.

15.Ng S.C., Hart A.L., Kamm M.A., Stagg A.J., Knight S.C. Mechanisms of action of probiotics: recent advances //Inflamm. Bowel Dis. – 2009. – Vol. 15 (2). – P. 300-310.

16.Laroche C., Michaud P. New developments and perspective applications for β (1,3) glucans // Recent Patents on Biotechnology. 2007. 1: 59-73.

17.Sekine K., Toida T., Saito M. et al. A new morphologically characterized cell wall preparation (whole peptidoglycan) from Bifidobacterium infantis with a higher efficacy on the regression of an established tumor in mice // Cancer Research. – 1985. – Vol. 45. – P. 1300-1307.

18.Schleifer K.H., Kandler O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications // Bacteriological Reviews. – 1972. – Vol. 36 (4). – P. 407-477.

19.Tada H., Nemoto E., Shimauchi H. et al. Saccharomyces cerevisiae- and Candida albicans-derived mannan induced production of tumor necrosis factor alpha by human monocytes in a CD14- and Toll-like receptor 4-dependent manner // Microbiol Immunol. – 2002. – Vol. 46 (7). – P. 503-12.

20.Weightberg A.B. A phase I/II trial of beta-(1,3)/(1,6) D-glucan in the treatment of patients with advanced malignancies receiving chemotherapy // J. Exp. Clin. Cancer Res. – 2008. – Vol. 27 (1) – P. 40-43.

21.Zähringer U, Lindner B, Inamura S, Heine H, Alexander C.TLR2 - promiscuous or specific? A critical re-evaluation of a receptor expressing apparent broad specificity // Immunobiology. – 2008. – Vol. 213 (3-4). – P. 205-24.

Реферат

Изучено протективное действие клеточных стенок Bifidobacteriumbifidumи Saccharomycescerevisiae, а также их комбинации на мышиной модели сепсиса, индуцированного минимальной летальной дозой Staphylococcusaureus. Бактериальные клеточные стенки обладали умеренной дозозависимой протективной активностью в условиях экспериментального сепсиса. Дрожжевые клеточные стенки проявляли тенденцию к увеличению выживаемости инфицированных животных. Композиция клеточных стенок бактерий и дрожжей предотвращала гибель значительной части мышей при их заражении минимальной летальной дозой возбудителя.

Ключевыеслова: Bifidobacterium bifidum, Saccharomyces cerevisiae, клеточныестенки, экспериментальныйсепсис, выживаемость

Summary

The influence of Bifidobacterium bifidum and Saccharomyces cerevisiae cell wall composition on survival of mice with experimental sepsis

Kalyuzhin O.V., Gitlin I.G., Kalina N.G., Mulik E.L., Naroditsky B.S., Logunov D.Yu., Tukhvatulin A.I.

Human morphology research institute of RAMS, Moscow; «NPK ECHO» Ltd., Moscow; I.I.Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera of RAMS, Moscow; N.F.Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow

Protective effects of Bifidobacterium bifidum and Saccharomyces cerevisiae cell wall preparations and their composition have been studied in a mouse model of sepsis induced by minimal lethal dose of Staphylococcus aureus. The bacterial cell wall preparation was found to possess moderate dose-dependent protective activity in the experimental sepsis model. The yeast cell wall preparation tended to increase survival of infected animals. Bacterial and yeastcell wall composition prevented the death of most of the mice infected with minimal lethal dose of pathogen.

Keywords: Bifidobacterium bifidum, Saccharomyces cerevisiae, cell wall, experimental sepsis, survival

Таблица 1

Определение заражающей дозыStaphylococcusaureus

Таблица 2

Влияние клеточных стенок бактерий и дрожжевых грибов на выживаемость мышей, зараженных культурой Staphylococcusaureus

Примечание: в таблице представлены данные 1 типичного из 3 независимых экспериментов.

* - p<0.05 в сравнении с контролем

⁺- p<0.05 в сравнении с С7МДП в дозе 10 мкг/мышь

^‡- p<0.05 в сравнении с ДКС в дозе 250 мкг/мышь