Изучение роли антиоксидантов в патогенезе бокового амиотрофического склероза.

Введение

Боковой амиотрофический склероз (БАС) — фатальное нейродегенеративное заболевание, обусловленное поражением двигательной коры и мотонейронов. Выявление причин избирательной гибели мотонейронов при БАС является одной из основных задач, стоящих перед исследователями. Ее решение позволит разработать новые современные патогенетические методы лечения данного заболевания.

По мнению большинства исследователей, ключевую роль в патогенезе БАС играет окислительный стресс [1-6]. Основная роль в развитии окислительного стресса в ЦНС отводится активным метаболитам кислорода (АМК) — супероксидному анион-радикалу (О2 ̇), перекиси водорода (Н2О2), гидроксильному радикалу (ОН ̇) и окиси азота (NO ̇). Главным источником АМК в организме человека и животных служат фагоциты: гранулоциты и моноциты крови и тканевые макрофаги. Мембраны фагоцитов содержат ферментативный комплекс (НАДФН-оксидазу), который окисляет НАДФН до НАДФ+ за счет восстановления двух молекул кислорода до супероксидного радикала. Активация фагоцитоза при любом нейродегенеративном процессе сопровождается развитием так называемого респираторного взрыва, связанного с чрезмерным выделением кислорода. Увеличение потребления О2 сопровождается активацией НАДФ-оксидазной системы и образованием О2. 

В дальнейшем в микроглии, как и в макрофагах, происходит образование Н2О2 , ОН и гипогалоидов, а далее повышается образование NO•. Легко диффундирующие в соседние нейроны Н2О2 , NO и токсические альдегиды способствуют продолжению свободнорадикального повреждения и прогрессированию нейродегенеративного процесса [7-10]. Кроме того, описаны механизмы образования Н2О2 в мотонейроне, которое может происходить в результате активации, например, ксантиноксидазы или при спонтанной дисмутации О2. Однако более 80% Н2О2 образуется в реакции дисмутации супероксидного анионрадикала, катализируемого ферментом супероксиддисмутазой (СОД) [11]. Прямое цитотоксическое действие Н2О2 на мотонейроны связано с ее способностью ингибировать анионный трансмембранный транспорт, увеличивать приток Са2+ в клетку, а при высоких концентрациях инактивировать некоторые ферменты, в частности СОД [12]; [13]. В работах in vitro была выявлена способность Н2О2 модулировать активность фактора транскрипции NF-кβ и индуцировать апоптоз нейронов [14]. 

Особая опасность повышения Н2О2 в мотонейронах связана с его способностью легко диффундировать через мембраны в соседние клетки, тем самым способствуя распространению свободнорадикального повреждения в ЦНС [15].

Таким образом, перспективной является разработка препаратов, нейтрализующих АМК, что может рассматриваться в качестве патогенетической терапии при БАС. К таким препаратам относятся антиоксиданты — природные или синтетические вещества, ингибирующие окисление. В качестве примеров антиоксидантов, протестированных для лечения БАС, можно назвать витамин С (аскорбиновая кислота), витамин Е (токоферол), N-ацетилцистеин, селегелин, дегидроэпиандростерон [16]. 

В проведенном нами исследовании оценивались свойства антиоксидантного препарата «Гитагамп Рутин-Железо» (GRuI). По своей структуре GRuI представляет собой комплекс с переносом заряда. Соединение GRuI в своей молекуле помимо рутина содержит, по крайней мере, два атома железа. Один атом имеет степень окисления +2 второй +3. В молекуле GRuI происходит перекрытие кооперированных р-орбиталей фенолов (рутин, полифенол) с незанятыми d-орбиталями атомов железа.

Реакция:

H2O2 + H2O2 = 2H2O + O2, является окислительно-восстановительной реакцией диспропорционирования.

При этом кислород в молекуле пероксида имеет степень окисления -1 в воде -2 и в молекуле кислорода степень окисления 0. В данном случае молекула GRuI выполняет роль катализатора. Катализаторы могут существенно увеличить скорость окислительно-восстановительной реакции. [16].

Скорость данной реакции, как и скорость ферментативных процессов, лимитируется диффузией. Молекула GRuI имеет существенное преимущество в эффективности разложения перекиси по сравнению с действием ферментов, что объясняется меньшим молекулярным весом (скорость диффузии пропорциональна массе) и отсутствием процесса активации, характерного для большинства ферментов.

Ферменты организма являются естественной антиоксидантной защитой. Действие ферментов-антиоксидантов Глутатион-пероксидазы, Каталазы происходит внутри клеток. В плазме крови функцию антиоксидантов выполняют Церулоплазмин и Апо-белок трансферрина.

На наш взгляд, происходит усиление антиоксидантной эффективности естественных антиоксидантов биологической защиты организма в присутствии природного соединения GRuI. У нас нет прямых доказательств проникновения GRuI внутрь клетки, однако в исследовании на культуре тканей, определение концентрации перекисей внутри клетки, в присутствии GRuI, достоверно показано снижение концентрации перекисей на 10%. 

Методы исследования

В лаборатории НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН исследовались антиоксидантные свойства препарата «Гитагамп Рутин-Железо» (GRuFe) и сравнивались со свойствами контрольного препарата Рутина. Антиоксидантные свойства препаратов были охарактеризованы двумя стандартными методами определения концентрации перекисных радикалов: в растворе — по окислению люминола и внутри клеток человека — по окислению 2'7' дихлорофлюоресцеина (DCF). Определение способности GRuFe элиминировать перекиси из раствора проводилось в стандартной среде для культивирования клеток DMEM с 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Для этого в культуральную среду, содержащую перекись водорода (350 мкМ), добавляли GRuFe до концентрации 0,375 мкг/мл. Через определенные промежутки времени производили отбор аликвот среды, к которым добавляли 15 мкМ люминола и пероксидазу хрена (8 mU/ml). По интенсивности люминисценции с помощью прибора Wallac 1420 определяли количество перекиси.

С целью подтверждения предположения способности GRuFe препятствовать накоплению экзогенных перекисей внутри клеток проводился эксперимент с культурой клеток НСТ-116 (клетки рака толстой кишки). При этом 2 x 106 клеток НСТ-116 инкубировали в темноте в присутствии 2,5 мкМ DCF при 37°C в течение 30 минут. После инкубации клетки дважды отмывали фосфатно-солевым буфером, трипсинизировали и анализировали на проточном цитометре (BD FACSCalibur). В культуральную среду НСТ-116 вносили GRuFe (до концентрации 0,375 мкг/мл), через 1 час инкубации добавляли перекись водорода (до концентрации 700 мкМ). Еще через 4 часа методом проточной цитометрии по флюоресценции окисленного 2'7' дихлорофлюоресцеина в клетках было определено относительное содержание перекисных радикалов.

В ходе клинического этапа исследования оценивалось влияние приема препарата GRuFe лицами, страдающими БАС. Препарат GRuFe принимался по 1 табл. 2 раза в день в течение 6 месяцев.

Полученные данные анализировались с помощью пакета прикладных программ STATISTICA с использованием сравнения доверительных интервалов относительных частот в двух группах, U-критерия Манна — Уитни, критерия Вилкоксона. 

Результаты и их обсуждение

Учитывая собственные данные о тенденция к более выраженной продукции именно пероксида водорода нейтрофилами крови больных БАС по сравнению с контрольной группой больных рассеянным склерозом [1], а также литературные данные о легкой диффузии перекиси водорода в окружающие астроциты, с чем может быть связан дальнейший каскад свободно-радикальных реакций, нами высказано предположение о взаимосвязи продукции и последующей диффузии перекиси с темпом прогрессирования заболевания.

В лабораторной части эксперимента в условиях in vitro и in vivo GRuFe показал высокую эффективность по дезактивации внеклеточной и внутриклеточной перекиси водорода. In vitro GRuFe в отличие от контрольного препарата (Рутина) уже в первые минуты вызывает резкое снижение содержания перекиси водорода в среде и полностью дезактивирует перекись уже через 4 часа после добавления. Эксперимент с использованием культуры клеток НСТ-116, в ходе которого оценивалась способность GRuFe препятствовать накоплению экзогенных перекисей внутри клеток, продемонстрировал, что GRuFe качественно элиминирует внутриклеточную перекись до уровня отрицательного контроля. 

Поскольку препарат GRuFe I показал себя высокоэффективным антиоксидантом, было предположено его положительное влияние на выживаемость клеток в условиях оксидативного стресса. Исходя из дизайна эксперимента, можно заключить, что препарат GRuFe в большей степени нейтрализует экзогенную перекись: клеточная культура выживала при добавлении препарата за 20 минут до обработки клеток перекисью и не выживала в условиях, когда пероксид водорода имел возможность диффундировать через клеточную мембрану, то есть если препарат добавлялся к уже обработанным перекисью клеткам. Выживаемость клеток при этом оценивалась двумя методами — окраской метиленовым синим и витальным красителем МТТ.

В клинической части исследования были получены следующие результаты. В качестве динамически изменяющегося критерия, отражающего степень прогрессирования заболевания и позволяющего составить прогноз выживаемости при БАС, использовались данные спирометрии. В течение 6 месяцев ежемесячно исследовалась жизненная емкость легких (ЖЕЛ) в двух группах пациентов. 

Первая группа включала пациентов, принимающих GRuFe, и состояла из 18 человек, среди которых 12 мужчин (67%) и 6 женщин (33%). Возраст пациентов данной группы колебался в пределах от 28 до 76 лет, в среднем составляя 48,5 года (34-62 года). Показатель ЖЕЛ в начале исследования (в месяц включения пациента в исследование) в среднем составлял 78,9% (56,8-98,6%) от должной жизненной емкости легких, вычисляемой по таблице с учетом роста и возраста пациента. Динамика изменения ЖЕЛ в исследуемой группе пациентов в течение полугода представлена на рисунке 1. 

Группу сравнения составили 17 пациентов, страдающих БАС и не принимающих антиоксиданты, среди них 9 мужчин (53%) и 8 женщин (47%). Возраст пациентов колебался от 29 до 72, в среднем составляя 63 лет (44-68 лет). ЖЕЛ в начале исследования в среднем составляла 85,0% (70,7-98,3%). Динамика изменения ЖЕЛ в группе сравнения представлена на рисунке 2.

Представленные диаграммы отражают меньшее снижение ЖЕЛ в группе пациентов, принимающих GRuFe. Данное наблюдение было подтверждено статистическими методами анализа.

Доказана сопоставимость вышеописанных групп пациентов по полу, возрасту и длительности заболевания при помощи сравнения доверительных интервалов относительных частот в двух группах и U-критерия Манна — Уитни (р>0,215). Однако следует отметить, что исследуемые группы не были сопоставимы по форме заболевания (р=0,0149). В дальнейшем сравнивались показатели ЖЕЛ в группе, принимающей GRuFe, до и после лечения и показатели ЖЕЛ в группе сравнения в момент начала исследования и спустя 6 месяцев с помощью критерия Вилкоксона. При использовании данного критерия ожидалось обнаружить отсутствие снижения ЖЕЛ, в группе, принимающей GRuFe, спустя 6 месяцев после начала приема препарата. Кроме этого, ожидалось выявить статистически значимые отличия уровня ЖЕЛ в группе сравнения до исследования и через 6 месяцев.

Были получены следующие результаты: р=0,157 Ме1=78,9 (56,8-98,6), Ме2=76,9 (53,8-91,8) для группы, принимающей препарат GRuFe и включающей 18 человек, и р=0,0007 Ме1=85 (70,0-98,3), Ме2=81 (47,8-88,0) для контрольной группы, состоящей из 17 человек.

Таким образом, не получено статистически значимого снижения уровня ЖЕЛ в группе GRuFe и выявлено статистически значимое снижение ЖЕЛ в группе, не принимающей препарат. Поскольку в группу сравнения было включено больше пациентов с более злокачественной бульбарной формой заболевания — 11 из 17 пациентов, в то время как в группе GRuFe бульбарной формой заболевания страдали 4 из 18 пациентов, а также, согласно литературным данным и нашим собственным наблюдениям, присоединение дыхательных нарушений при бульбарной форме заболевания происходит раньше [17-19], показанную статистическую значимость результатов проведенного исследования можно поставить под сомнение. В связи с этим полученные результаты расцениваются нами как выявленная тенденция к менее выраженному снижению ЖЕЛ у пациентов, страдающих БАС, на фоне приема препарата GRuFe.

Таким образом, с целью подтверждения эффективности приема GRuFe при БАС в качестве возможной патогенетической терапии необходимо проведение плацебо-контролируемого исследования. Данный же эксперимент продемонстрировал высокую антиоксидантную активность GRuFe, показанную в экспериментах in vitro и in vivo, и безопасность его применения у пациентов, страдающих БАС, а также подтвердил целесообразность назначения антиоксидантов при БАС в качестве патогенетической терапии. 

ЛИТЕРАТУРА

1. Захарова М.Н. Боковой амиотрофический склероз и окислительный стресс (клинико-биохимическое исследование). Дис. докт. мед. наук. — М.: НЦН РАМН, 2001. — 255 с.

2. Liu D., Wen J. // Faseb J. 1999. V. 13. Р. 2318-28.

3. Morrison B.M., Morrison J.H. // Brain Res Brain Res Rev. 1999. V. 29. Р. 121-35.

4. Aguirre T., Van Den Bosch L. // Ann Neurol. 1998. V. 43. P. 452-7.

5. Alexianu M.E., Ho B.K. // Ann Neurol. 1994. V. 36. P. 846-58.
6. Rosen D.R. // Nature 1993. V. 364. P. 59-62.
7. Ischiropoulos H., Zhu l., Chen J. // Arch. Biochem. Biophys. 1992.V. 298. P. 431-437.

8. Kreutzberg G.W. // TINS. 1996. V. 19. P. 312-318.
9. Merrill J.E., Benveniste E.N. // TINS. 1996. V. 19. P. 331-338. 10. Nikolic-Kokic A., Stevic Z. // Clin Chem Lab Med. 2006. V. 44. P. 589-93.

11. Cross A.R., Jones O.T. // Biochim. et Biophys. Acta. 1991.V. 1057. P. 281-298.

12. Зенков Н.К., Мениликова Е.Б., Шергин С.М. // Окислительный стресс: диагностика, терапия, профилактика. Новосибирск. 1993. 305 с.

13. Halliwell B. // Nutr. Rev. 1995. V. 52. P. 253-265.

14. Behl C., Davis J.B., Lesley R., Schubert D. // Cell 1994. V. 77. P. 817-827.

15. Makino N., Mochizuki Y., Bannai S., Sugita Y. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 1020-1025.